Wako和光纯药 Phos-tag™ 实验设计及应用实例

研究领域

磷酸化蛋白和磷酸化多肽的研究

◆Phos-tag™ 的简介

Phos-tag™是由日本广岛大学的Kinoshita教授团队研发的磷酸化蛋白捕获分子。Phos-tag™ 螯合Zn2+或者Mn2+重金属离子后形成一个半封闭的空间。在pH值6~8的中性条件下,该空间恰好能容纳一个磷酸基团,使得螯合有金属离子的Phos-tag™ 分子能够与磷酸基团牢固而稳定的结合。可以特异性结合所有氨基酸的磷酸化基团,广泛运用于细菌,酵母,昆虫等物种研究。

◆Phos-tag™ 系列产品

利用螯合有金属离子的Phos-tag™ 可以特异性结合磷酸化基团的特点,研发了Phos-tag™ 系列产品,运用于常见的蛋白实验,比如SDS-PAGE、免疫印迹、亲和层析以及质谱等。

提示:除Phos-tag™ Mass Analytical kit之外,其他Phos-tag™ 系列产品都需要配制金属离子(Zn2+或者Mn2+)溶液。

◆具体实例

1. 体外激酶反应,激酶和底物都带有标签,反应后亲和层析法纯化获得激酶和底物,如何检测底物的磷酸化情况?

如果底物和激酶分子量差别大,条带通过普通的SDS-PAGE能够区分,建议进行普通SDS-PAGE后再使用Phos-tag™ Biotin进行Western Blotting。在Western Blotting实验中,使用Phos-tag™ Biotin作为“抗体”检测底物磷酸化基团(需记录底物的条带位置)。可通过剥离(strip)方式剥离Phos-tag™ Biotin,用底物的非磷酸化抗体进一步验证其位置。

如果底物和激酶分子量差别不大,可进行Mn2+-Phos-tag™ SDS-PAGE实验,然后转膜,用底物的非磷酸化抗体检测(没有使用激酶的抗体,所以检测不到激酶的带)。在Mn2+-Phos-tag™ SDS-PAGE中磷酸化和非磷酸化底物发生分离,用底物的非磷酸化抗体可以检测所有底物。免疫印迹实验后,观察所有的条带,非磷酸化底物由于没有和Mn2+-Phos-tag™丙烯酰胺结合,所以迁移速度较快,磷酸化底物则迁移速度变慢。通过迁移率的变化,分析磷酸化底物的含量。

备注:

1) Mn2+-Phos-tag™ SDS-PAGE实验中,建议使用α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated(038-23221)作为阳性对照,该产品中含有磷酸化和非磷酸化的α-Casein,确保试剂和实验条件能够分离磷酸化蛋白。

2)如果没有非磷酸化底物,可使用AlkalinePhosphatase(for Biochemistry)(018-10693)对底物进行去磷酸化反应。

2. 如何检测EGF(表皮生长因子)刺激后细胞内MAPK的磷酸化水平?

收集EGF刺激的细胞,制备细胞裂解液作为样品。进行正常的SDS-PAGE实验和Mn2+-Phos-tag™ SDS-PAGE实验,转膜后用MAPK的非磷酸化抗体作为一抗进行检测(检测所有的MAPK,包括磷酸化和非磷酸化)。正常SDS-PAGE实验中,磷酸化的MAPK和非磷酸化MAPK没有分离,而在Mn2+-Phos-tag™ SDS-PAGE实验中磷酸化MAPK和非磷酸胡MAPK发生分离,所以转膜后,用MAPK抗体检测,可以看到分离的条带。比较正常的SDS-PAGE用MAPK抗体的免疫印迹实验和Mn2+-Phos-tag™ SDS-PAGE用MAOK抗体的免疫印迹实验,多出来的条带就是磷酸化的MAPK。

备注:该实验的前提是EGF刺激后细胞内的MAPK发生磷酸化,细胞内包含磷酸化和非磷酸化的MAPK。如果刺激后细胞内不含有磷酸化的MAPK,则无法用Phos-tag™ 丙烯酰胺分离磷酸化和非磷酸化MAPK。

3. 研究蛋白相互作用的实验中,构建带有不同标签的2种融合蛋白,共转染细胞,在细胞内发生磷酸化反应。通过不同标签的亲和层析柱获得纯化的蛋白,是否可用Phos-tag™ Agarose纯化,进行后续免疫共沉淀(Co-IP)实验?

Phos-tag™ Agarose纯化磷酸化蛋白,采用高盐的洗脱方式,没有使用界面活性剂、还原剂、酸或者碱洗脱,蛋白不发生变性,可进行后续的Co-IP实验。

 

4. 检测的样品中含有两种磷酸化的蛋白,分子量很接近,如何使用Phos-tag™ 产品检测磷酸化?

如果样品中两种磷酸化蛋白的分子量很接近,通过正常的SDS-PAGE实验无法区分,建议使用Phos-tag™ 丙烯酰胺。进行Mn2+-Phos-tag™ SDS-PAGE实验后用两种蛋白的非磷酸化抗体进行检测。

也可以使用Phos-tag™ Biotin。进行正常SDS-PAGE实验后,先用两种蛋白的非磷酸化抗体进行检测,剥离(strip)后用Phos-tag™ Biotin。如果磷酸化蛋白量少的话,剥离(strip)会去除一些蛋白,可能会影响检测的效果。

5. 使用Phos-tag™ Mass Analytical kit,样品中如果含有磷酸缓冲液是否有影响?

该试剂盒检测磷酸化蛋白和多肽的灵敏度较高,样品中含有的磷酸缓冲液会影响磷酸化蛋白与Phos-tag™ 结合。

◆产品列表


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