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与常规的非变性细胞裂解缓冲液(RIPA buffer,1% Triton X-100等)相比,这款缓冲液套装(Buffer Kit)能迅速且高效地提取增溶相对困难的脂筏(Lipid Raft)蛋白质。从常规缓冲液中不可溶而丢弃的膜组分中,在维持蛋白质功能的情况下能实现高效地提取,有利于对脂筏等蛋白质的功能分析。

※ 本产品仅限于研究用。不可用于临床治疗。

 ◆细胞膜上的不溶性成分——脂筏(Lipid Raft)

裂解细胞进行蛋白质功能分析的时候,经常会使用RIPA(Radio-Immuno Precipitation Assay)缓冲液和1% Triton X-100缓冲液等的相对温和的细胞膜裂解缓冲液。这些缓冲液对蛋白质的构造和功能的影响小,适用于酶活性试验、免疫沉降和各种结合实验等蛋白质的功能分析。另一方面,与具有很强的蛋白质变性作用的SDS缓冲液相比,增溶能力较弱,完全不能溶解以脂筏(Lipid Raft)为主的细胞膜组分。许多表面活性剂都不能溶解脂筏,故其又被称为Detergent Resistant Membrane(DRM)。DRM中所含蛋白质的功能分析被认为是十分困难的。

 

 

脂筏(Lipid Raft)是由胆固醇(cholesterol)和鞘磷脂(sphingomyelin),GPI锚定蛋白(GPI anchor protein)和棕榈酰化(palmitoylation)蛋白质组成的细胞膜构造,被认为是整合各种功能蛋白的功能域。神经细胞突触和免疫细胞的免疫突触是脂筏的代表性例子。

 

脂筏示意图

◆特点

● 操作简单,能快速提取脂筏蛋白

● 使用两种类型的缓冲液(A buffer,B buffer)进行两个阶段的提取。先提取出胞浆蛋白和非脂筏蛋白,然后提取脂筏蛋白

● Buffer提取的任何蛋白质都不会失活

● A buffer和一般的RIPA buffer成分相同*。B buffer含有表面活性剂,可以通过透析除去

● 适用于哺乳动物细胞/组织

● 使用本品配制的溶解液适用于酶活性试验、免疫沉淀(Immunoprecipitation)、蛋白定量(BCA法)、SDS-PAGE和Western blot等

*1% NP-40 Alternative,0.1% SDS,50 mMTris-HCl (pH8.0),150 mMNaCl,0.5% Sodium Deoxycholate

◆缓冲液套装组成

● A buffer(RIPA buffer)(100 mL)

● B buffer(10 mL)

 

◆应用实例

从脂筏中提取总蛋白

用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全脑组织后,回收A buffer不溶性组分(RIPA-insoluble fraction),添加2% SDS,RIPA buffer和UltraRIPA kit B buffer进行提取。提取后的总蛋白用SDS-PAGE/银染色检测(左),用BCA法定量蛋白质(右)。相对于具有很强的蛋白质变性作用的2% SDS 缓冲液,UltraRIPA kit 能够提取70%以上的蛋白质。

※不能保证全部蛋白质的可溶性都得到改善。

脂筏标记蛋白的提取

用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全脑组织后,回收A buffer不溶性组分(RIPA-insoluble fraction),添加2% SDS,RIPA buffer和UltraRIPA kit B buffer,提取后进行SDS-PAGE。利用对应脂筏标记蛋白的抗体进行Western blot检测。

 

脂筏标记蛋白的免疫沉淀

用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全脑组织后,回收A buffer不溶性组分,通过B buffer提取脂筏标记蛋白。对buffer提取物使用脂筏标记蛋白PSD95的抗体和G蛋白偶联磁珠进行免疫沉淀。使用银染色和抗PSD95抗体通过Western blot检测进行确认。

 

提取的蛋白质的酶活性测定

用1% Triton X100,RIPA buffer,UltraRIPA kit B buffer和2% SDS溶解CHO细胞,测定溶解物中乳酸脱氢酶(LDH)的活性。2% SDS具有很强的蛋白质变性作用,在几乎完全失活的情况下,1% Triton X100,UltraRIPA kit A buffer,和UltraRIPA kit B buffer 所得的酶活性大致相同。

 

◆各buffer组成

● SDS buffer(2% SDS, 1% Triton X-100, 50 mM HEPES・Na(pH 7.2),150 mM NaCl)

● UltraRIPA kit A buffer(1% NP-40 Alternative,0.1% SDS,50 mM Tris-HCl(pH 8.0),150 mM NaCl,0.5% Sodium Deoxycholate)

● UltraRIPA kit B buffer(成分保密)

● 1% Triton X-100 (1% Triton X-100, 50 mM HEPES・Na(pH 7.2),150 mM NaCl)

◆产品列表

※ 仅供实验研究用,不可用于临床诊断。


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