NucleoSeeing是与DNA特异性结合并发出绿色荧光的实时成像用细胞核染色试剂。

细胞核作为DNA的储存库，负责细胞分裂和控制基因表达，是细胞中最重要的细胞器之一。因此细胞核动力学的动态实时成像就成为了非常重要的课题。虽然核酸应答性的蓝色荧光色素Hoechst系列和DAPI被广泛运用，但由于这些蓝色荧光素使用紫外线作为激发光，光毒性强，不适用于活细胞成像。

NucleoSeeing是名古屋工业大学的筑地真也教授等人开发的DNA特异性绿色荧光化合物，可以在细胞培养，组织培养以及拟南芥叶等的植物细胞中进行活细胞成像。

各种细胞核染料的比较参数

※本产品仅供科研使用。严禁用于科研以外用途。

使用了NucleoSeeing的各种样本

将HeLa细胞（左），拟南芥表皮细胞和保卫细胞（中），小鼠脑海马切片培养（右）活细胞成像后进行观察。

◆原理

_{NucleoSeeing是细胞膜渗透性的绿色核染色试剂，由绿色荧光色素和DNA特异性结合tag组成。本产品在DNA不存在时显示折叠构造，虽然有消光状态，但与DNA结合时构造发生改变，发出绿色荧光。由于NucleoSeeing摄入细胞内后与DNA结合时发出绿色荧光，因此可以特异性观察细胞核。}

◆特点

● 仅在与DNA结合时发出绿色荧光，显示高S/N比。由于在培养基中会消光，因此在添加了培养基的状态下也可以高灵敏度地进行观察

※想要提高灵敏度，则建议染色后更换培养基后再进行观察。

● 激发光/发射光波长：488 nm/520 nm

● 和传统的Hoechst等试剂相比，几乎没有发现细胞毒性。

● 不仅仅是活细胞成像，还可以染色固定细胞，活细胞成像后再固定细胞进行观察，也可以用于免疫染色实验。

● 无论是动物来源的细胞和组织培养，还是植物细胞（拟南芥叶细胞），都可以进行高S/N比的核染色。

● 观察植物细胞时，不受叶绿体来源的自身荧光（Em：>615 nm）的影响，可以仅将细胞核可视化。

● 能够可逆性染色。培养基更换12~24小时后，染料几乎全部被排出细胞外。

● 由于可以看见pH依赖性的荧光强度的变化，所以在pH 6~8之间，可以通过2个波长的荧光强度比（Ex 405 nm, Em 520 nm / 460 nm），作为细胞核内的pH sensor使用。

◆应用

● 动物来源培养细胞的活细胞成像

● 植物细胞的活细胞成像

● 免疫染色中的细胞核染色

● 细胞核内pH sensor（pH 6~8）

◆应用实例

可逆性染色

_{为了评价Hoechst33342和NucleoSeeing的细胞滞留性，分别用1 μM两种试剂处理15分钟后，更换培养基，去除剩余的试剂，观察24小时荧光强度的变化。Hoechst33342在24小时后依然维持80%的荧光强度，显示出不可逆性，与之相对NucleoSeeing随着时间推移，荧光强度逐渐减弱，12小时以后几乎全部排出。因此，NucleoSeeing可以作为可逆性的核染色试剂使用。}

各种培养细胞的核染色

添加1 μM的 NucleoSeeing 至各种培养细胞的培养基中，染色15分钟后，更换培养基观察活细胞，无论哪种细胞都观察到了核特异性的信号。

拟南芥叶的保卫细胞染色案例

_{用20 μM 的NucleoSeeing处理拟南芥叶的切片60分钟后，清洗切片进行观察。激发光为488 nm时，在绿色荧光范围490~555 nm内观察保卫细胞的细胞核，615 nm以上波长范围中观察到叶绿体来源的自身荧光。通过使用本试剂，可以在观察时区分叶绿体的自身荧光和细胞核荧光，期待本品可作为植物细胞的核动态成像试剂使用。}

_{※拟南芥叶的保卫细胞的核染色是由名古屋工业大学的筑地教授等人和东北大学上田实教授等人共同研究发现的成果。}

◆使用NucleoSeeing作为细胞核pH sensor

^{_{细胞核有着由外膜和内膜这两层脂质双分子层膜构成的核膜这种独特结构，与细胞质分隔开来。细胞核内和细胞质之间的物质交流需要通过细胞核孔进行，但学者们认为细胞核内的环境和细胞质的环境是不同的。近年，有学者提出核膜中存在核膜特异性质子泵（H+ -ATPase），在细胞核和细胞质之间产生质子梯度。虽然可以期待通过生理现象变化来检测细胞核内的pH值，但是至今还没有开发出十分理想的试剂。}}

^{_{名古屋工业大学筑地教授等人证明NucleoSeeing具有pH依赖性荧光特性，可以作为细胞核传感器使用。NucleoSeeing作为细胞核染色试剂，一般在激发光480 nm/荧光520nm的范围使用，但是在激发光405 nm时使用的话，在460 nm以及520 nm左右的荧光会依赖pH值发生变化。通过检测激发光405 nm时460 nm和520 nm的荧光强度比（F520/ F460），观察pH5.5～8.5之间的S形曲线。利用这个原理，就可以评估细胞核内的pH值。}}

◆NucleoSeeing用作细胞核内pH sensor的原理和特点

（参考数据）in vitro中NucleoSeeing的pH依赖性荧光特性

左：在NucleoSeeing的激发波长405 nm时荧光光谱和pH依赖性。在pH 5.5~8.5之间，460 nm和520 nm附近的荧光强度随着pH值降低而增强。

右：在各pH值中，460 nm和520 nm的荧光强度F（激发波长405 nm）和荧光强度比(F520/ F460)。

<注>NucleoSeeing针对活细胞用的细胞膜渗透性进行了优化，摄入细胞内以后，被酯酶水解并转化为活性本体。本数据是为了验证使用了化学合成的活性本体（NucleoSeeing的水解产物）进行in vitro获得的数据。请注意直接使用NucleoSeeing进行in vitro不可能重现本数据。

◆在in cellulo中使用NucleoSeeing观察细胞核内pH

用NucleoSeeing染色培养细胞（HeLa细胞）后，用含有K⁺/ H⁺ 离子载体Nigericin* 的pH buffer培养后，用共聚焦显微镜观察在激发光405nm时的荧光强度比（FFluorescein / FHoechst）

左：各pH值的荧光观察图像

右：定量结果分析

与in vitro相同，可以观察到pH依赖性和荧光强度比的对应关系，并且预估生理性（未添加Nigericin）的核内pH值为7.4。

* Nigericin是代表性的K⁺/ H⁺ 离子载体，在细胞外溶液的pH值和细胞内pH值一致时使用。

◆产品列表

※ 仅供实验使用，不可用于临床诊断。